以亞磷酰胺寡核苷酸合成為例介紹該類儀器的一般操作步驟。亞磷酰胺DNA合成的試劑有:保護堿基的5/—DMT,A、G、C、T亞磷酰胺單體,四唑偶聯(lián)催化劑,乙酐,N—甲基咪唑封閉試劑,三***(TCA)脫保護溶液,12氧化混合物,乙腈清洗溶劑,氨水切除溶液。使用步驟如下: 1)仔細(xì)檢查合成儀上所有試劑瓶中的試劑量,必要時換掉試劑瓶,特別注意乙腈的量,因為該溶劑用量較大。
2)將標(biāo)記好的清潔的收集瓶裝在合成儀上。
3)將要合成的DNA序列輸入合成儀。
4)檢查選擇的合成步驟是否正確。
5)選擇結(jié)束方法:TritylOffAuto是儀器的原始狀態(tài),若打算以5,—DMT基團連接純化寡核苷酸,將其轉(zhuǎn)變?yōu)門ritylOnAuto結(jié)束狀態(tài)。
6)如果分部收集器用來收集每個DMT脫保護步驟的流出物,確保試管充分清潔干凈,并打開分部收集器,確保DMT廢液管路通向分部收集器。
7)啟動循環(huán),運行開始程序清洗試劑管路,除去原來的試劑。
注意:TritylOnAuto表示在合成寡核苷酸的5’端核苷酸帶有一個DMT,并將其從固相載體上切下來,儲存在收集瓶中;TritylOffAuto表示在合成寡核苷酸的5,端核苷酸沒有保護基團,將其從固相載體上切下來,儲存在收集瓶中;TritylOnManual表示合成寡核苷酸的5’端核苷酸帶有一個DMT,寡核苷酸沒有從固相載體上切下來,而是保留在合成柱中;TritylOffManual表示在合成寡核苷酸的5,端核苷酸沒有保護基團,寡核苷酸沒有從固相載體上切下來,而是保留在合成柱中。
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